DNA甲基化专题|乳腺癌中的DNA甲基化标志物研究

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，它是威胁全球女性健康的严重的常见的恶性肿瘤之一，近年来的发病率与死亡率也逐渐升高。因此，寻找和发现有价值的乳腺癌生物标志物已经成为目前研究的一个重要方向。小编这次为大家分享两篇关于研究乳腺癌DNA甲基化标志物的文章（IF > 10），利用多组学数据分别从两个方向筛选甲基化标志物的研究。

01

案例一

易感基因BRCA1和BCRA2通过同源重组（Homologous Recombination，HR）对DNA进行修复，当BRCA1和BCRA2发生致病性突变，导致同源重组缺陷（HR-deficient，HRD)，损伤的DNA难以得到修复，容易导致三阴性乳腺癌（TNBC）等恶性肿瘤的发生。40% - 70%的TNBC肿瘤具有HRD表型，且BRCA1/ BRCA2突变的乳腺癌被认为比非HR缺陷瘤更具免疫原性。有研究表明，增加免疫原性可以起始更好的免疫检查点的连锁反应，但是这一机制仍不明确。瑞典隆德大学今年7月份在Nat Commun（IF 12.121）上发表了《Comprehensive molecular comparison of BRCA1 hypermethylated and BRCA1 mutated triple negative breast cancers》，通过全面比较BRCA1高甲基化和BRCA1突变的TNBC患者的分子生物学特征，以确定BRCA1甲基化水平在TNBC中的功能。

研究思路

作者利用已经报道的237例未分群的三阴性乳腺癌（TNBCs）患者（SCAN-B）以及54例BRCA1突变肿瘤患者的WGS、RNA-seq、WGBS、焦磷酸测序数据，分析了早期TNBC中BRCA1启动子高甲基化的频率，和BRCA1功能缺失 （体细胞/种系突变、BRCA1缺失）的肿瘤表型及其与临床病理变化、分子亚型和患者预后的关系。作者发现，在早期未分群的TNBC中，BRCA1高甲基化的发生率是BRCA1功能缺失肿瘤的两倍，并且在肿瘤高甲基化患者的外周血DNA中可以检测到BRCA1启动子甲基化的升高。此外，从突变、表观遗传学、转录和免疫浸润表型分析中发现，BRCA1高甲基化与BRCA1功能缺失患者的肿瘤表型几乎相同。与非BRCA1失活的TNBC患者相比，辅助化疗后BRCA1高甲基化和BRCA1功能缺失患者的预后更好，说明BRCA1高甲基化很可能是早期TNBC发生的生物标志物。

结果展示

图1. BRCA1高甲基化，基因表达和HRD关联分析。作者通过对235例TNBC患者BRCA1启动子的焦磷酸测序结果和237例TNBC患者BRCA1 mRNA结果分析发现，高甲基化的BRCA1显著抑制了mRNA的表达。HRD关联分析发现，BRCA1缺陷癌症的典型特征是重排和微同源性缺失。且WGS结果表明，肿瘤细胞含量与CpG位点甲基化线性相关。这些结果显示，BRCA1高甲基化比BRCA1缺失病例的发生频率高2.3倍，比BRCA1种系改变的发生频率高3倍。同时，作者对致病性的BRCA2双等位基因变异患者PD35990a进行分析发现，其肿瘤是以BRCA1缺陷为特征的BRCA1高甲基化增加和BRCA1 LOH（loss of heterozygosity）等特点。

图2. 外周血BRCA1甲基化、基因表达亚型和治疗后的预后。通过对TNBC患者年龄以及外周血甲基化分析显示，年轻患者(50岁以下TNBC患者中46.2%)的BRCA1高甲基化频率较高，说明BRCA1高甲基化可能是TNBC患者的潜在致病因素。接着，作者用Cox分析和KM分析统计了BRCA1高甲基化患者和非BRCA1患者的生存情况，发现BRCA1高甲基化患者预后会更好。说明BRCA1高甲基化患者预后改善的原因可能与HRD表型有关。

图3. BRCA1高甲基化和BRCA1缺失的TNBC患者的遗传表型比较。分别对BRCA1高甲基化和BRCA1缺失的TNBC患者的基因组拷贝数改变频率、驱动基因拷贝数扩增频率、驱动基因突变(插入、缺失、替换)的频率，两组样本的取代、indels和重排总数以及包括两种BRCA1/BRCA2相关标记(RS3和RS5)的六种重排标记和层次聚类、主成分分析进行比较，发现BRCA1高甲基化和BRCA1缺失的TNBC患者分子生物学特征接近。

图4 . BRCA1高甲基化和BRCA1缺失的TNBC的DNA甲基化和转录特征。25例BRCA1缺失和57例高甲基化SCAN-B病例的甲基化数据进行了比较, 差异甲基化分析确定了32个显著的CpGs且都与BRCA1相关。对32个CpGs的聚类分析发现在235个TNBC患者中，BRCA1高甲基化和非甲基化的TNBC有明显差异。转录组无监督聚类和主成分分析显示，BRCA1高甲基化和BRCA1缺失的TNBC患者的基因表达无明显改变。

图5. BRCA1高甲基化和BRCA1缺失的免疫细胞浸润表型。在免疫组化实验中评估53例BRCA1高甲基化和25例BRCA1缺失患者的PD-L1评分，结果显示无显著差异。

（https://doi.org/10.1038/s41467-020-17537-2）

02

案例二

DNA甲基化在乳腺癌的发展过程中起着关键作用。之前的研究已经发现，白细胞中的DNA甲基化修饰可以作为一种很有前景的乳腺癌生物标记物。然而，以前的研究普遍被低统计效力和潜在的偏差限制。今年3月份牛津大学在J Natl Cancer Inst（IF 11.577）上发表了一篇《Genetically Predicted Levels of DNA Methylation Biomarkers and Breast Cancer Risk: Data From 228951 Women of European Descent》，建立了一种新的机器学习方法可以识别乳腺癌中的甲基化标志物。

研究思路

分析结果如下:

作者首先使用来自Framingham（FHS）心脏研究中心的1595例患者450K芯片的DNA甲基化数据集中的多个SNP数据，建立统计模型来预测白细胞DNA甲基化标志物的水平，再使用来自Women’s Health Initiative （WHI）的883患者的数据进一步对预测模型进行了验证。接着，将模型应用于122977例乳腺癌患者和105974例对照的GWAS数据集中，以评估所预测的CpGs位点的DNA甲基化水平是否与患乳腺癌风险相关。结果发现，在所检测的62938个CpG位点中，450个CpGs位点与乳腺癌风险在统计学上显著相关，其中包括45个以前没有报道过的位于18个基因组区域的CpGs位点。其余405个CpGs位点位于70个被GWAS鉴定为乳腺癌风险变体的上下游500Kb区域内，另外11个CpGs位点独立于被GWAS鉴定的变异体外。通过对SNP数据、DNA甲基化和基因表达数据的综合分析，发现38个CpGs位点可能会通过调节21个基因的表达来影响患乳腺癌风险。其中，GSTM4、SLC22A5和IMP3 3个基因中有5个CpGs均位于GWAS中与乳腺癌风险不相关的基因组区域。GSTM4过表达有助于维持细胞色素c的降低状态，从而增加乳腺癌细胞对甲氨蝶呤的抵抗。有报道称，SLC22A5突变可增强乳腺组织的癌细胞转移。在BRCA突变的浸润性乳腺癌中发现了IMP3的表达增加。CD160与细胞抗癌活性有关，有三个CpGs位于CD160中，通过下调CD160的表达，增加患乳腺癌的风险。另外有3个CpGs位于MAPT中，与乳腺癌转移有关。

（https://doi: 10.1093/jnci/djz109）

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